Molecular detection and identification of Candida and Aspergillus spp. from clinical samples using real-time PCR

Este informe describe el desarrollo de un ensayo LightCycler en tiempo real para la detección e identificación de Candida y Aspergillus spp., Utilizando el MagNa Pure LC instrumento para la extracción automatizada de ADN fúngico. El ensayo toma 5-6 h de realizar. Los cebadores de oligonucleótidos y sondas utilizados para la identificación de especies se obtuvieron a partir de las secuencias de ADN de los genes 18S rRNA de varios patógenos fúngicos. Todas las muestras fueron seleccionados para Aspergillus y Candida a nivel de género en el ensayo de PCR en tiempo real. Si una muestra fue Candida positivo, se realizó la tipificación a nivel de especie utilizando sondas específicas de especie cinco. El ensayo detectó e identificó la mayor parte del clínicamente relevante Aspergillus y Candida spp. con una sensibilidad de 2 CFU / ml de sangre. La amplificación fue del 100% específica para todos Aspergillus y Candida spp. probado. Para evaluar la aplicabilidad clínica, 1.650 muestras consecutivas (1330 muestras de sangre, 295 muestras de otros fluidos corporales y 25 muestras de biopsia) de pacientes con sospecha se analizaron las infecciones fúngicas invasivas. En total, 114 (6,9%) muestras fueron PCR positiva, del 5,3% para Candida y el 1,7% para Aspergillus spp. En los pacientes con resultados positivos de PCR para Candida y Aspergillus, la verificación con los métodos convencionales era posible en el 83% y el 50% de los casos, respectivamente. En conclusión, el ensayo de PCR en tiempo real permite la detección e identificación de patógenos fúngicos in vitro e in vivo sensible y específico.